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Review Borrelia

Review Borrelia burgdorferi sensu lato

Prof. Dr. Martin Sievers, Hochschule Wädenswil

Die Diagnostik der Lyme-Borreliose stützt sich auf:
- Zeckenstichanamnese
- klinische Untersuchungsbefunde (z.B. Erythema migrans (EM), Akrodermatitis chronica atrophicans (ACA))
- Serologie (ELISA und Westernblot zum Nachweis von IgG- und IgM-Antikörpern)
- kultureller Keimnachweis
- PCR

Lebenszyklus der Zecke
Symptome und Manifestierung der Lyme-Borreliose wurde zuerst in Schweden und Deutschland beschrieben. 1983 entdeckte W. Burgdorfer Spirochäten in der Zecke Ixodes ricinus und stellte den Zusammenhang zur Lyme-Borreliose dar. Der Zecken-Lebenszyklus startet im Frühjahr ausgehend von den Eiern über die Larve bis zum Nymphenstadium. Während des Entwicklungsweges von der Larve zum Nymphenstadium ernährt sich die Larve im Sommer von Vögeln und Nagetieren. Im Winter ist die Zecke im Nymphenstadium nicht aktiv. Der Weg vom Nymphenstadium zur ausgewachsenen Zecke startet wieder im Frühling, wobei vorwiegend im Sommer Menschen, Haustiere, Wild und Nagetiere als Wirt dienen. Im Winter ist die Zecke aktiv, wobei der Wirt Menschen, Haustiere und Wild sind (Diterich und Hartung, 2001).

Genom
Borrelia sp. sind Gram-negativ gehörend zur Familie der Spirochaetaceae mit 7-11 periplasmatischen Flagellen und charakterisiert durch eine äussere Membran (outer membrane). Diese äussere Membran setzt sich aus Proteinen, Lipiden und Karbohydraten zusammen und besitzt antigene Proteine, wie die Oberflächenlipoproteine (osp). Das Genom von Borrelia burgdorferi B31 ist sequenziert (NC_001318) mit einem linearen Chromosom von 910'725 kbp und 11 Plasmiden (circulär und linear). Das Chromosom enthält 853 Gene, auf die Plasmide entfallen 430 Gene (Fraser et al., 1997). Oberflächenproteine wie ospA, ospC sind plasmidcodiert. OspA ist auf einem linearen Plasmid von 49 kbp kodiert. Das Gen bba65 (p35) ist auf dem 54-kbp linearem Plasmid lokalisiert und kodiert für ein 35-kDa Protein, welches bei der Infektion von Menschen aktiv ist (Antikörperbildung). Das Gen pG (homolog zu ospF) kodiert für ein Lipoprotein mit der Grösse von 22 kDa und ist auf einem 48 kb-Plasmid lokalisiert. pG scheint ebenfalls erst im Patienten exprimiert zu werden (Wallich et al., 1995). Die kürzlich beschriebene Genkassette vls (variable-major-protein-like-sequence) ist auf dem linearen Plasmid (lp28-1) nahe der Telomersequenz lokalisiert.

Species
Borrelia besteht aus zehn verschiedenen Arten, wobei B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B. afzelii (B. burgdorferi sensu lato-Gruppe) pathogen für den Menschen in Europa sind. B. valaisiana, entdeckt in der Schweiz, wurde in "skin lesions of erythema migrans" Patienten isoliert und steht in Zusammenhang mit pathologischen Symptomen. Mit einer durchschnittlichen Infektionsrate der Zecken mit Borrelia sp. von 35% in D-Konstanz wurden 53% als B. afzelii, 18% als B. garnii und 11% als B. burgdorferi sensu stricto identifiziert (Rauter et al., 2002). Von 6'071 Zecken der Art Ixodes ricinus in der Schweiz waren 26.5% mit B. burgdorferi sensu lato infiziert (Wicki et al., 2000). Dieser Nachweis erfolgte über den inneren Sequenzabschnitt des Flagellingenes, wobei Coinfektionen mit Borrelia und Ehrlichia festgestellt wurden (Leutenegger et al., 1999). Das Auftreten der Lyme-Borreliose liegt bei 30.4 Einwohner pro 100'000 Einwohner pro Jahr in der Schweiz (Diterich und Hartung, 2001).
Borrelia burgdorferi sensu stricto ist mit Arthritis assoziiert, Borrelia garinii verursacht Neuroborreliose und Borrelia afzelii verursacht Acrodermatitis chronica atrophicans (ACA, entzündliche Hautveränderungen).

Kultivierung
Barbour-Stoenner-Kelly II (BSKII) und BSKH-Medium wird für die mikrobiologische Kultivierung von Borrelia burgdorferi verwendet. Physiologische Faktoren (Temperatur, pH, Zelldichte) haben Einfluss auf die Genexpression von Oberflächenproteine wie ospA, ospC und Lipoprotein wie mlp. Auf BSKII-Medium erfolgt bei Wachstum von B. burgdorferi eine gleichbleibende Expression von ospA und ospC. Hingegen wird bei Wachstum auf BSKH eine stärkere Expression von ospC und schwache Expression von ospA beobachtet. Flagellin flaB wird bei beiden Medien gleichmässig exprimiert (Yang et al., 2001).
Eine zeitlich schnellere Kultivierung von Borrelia burgdorferi wird in Maus-Fibroblasten (L-929 Zellinie) erzielt. Bei einer Inokulum-Menge von 10 Zellen wurde unter den aufgeführten Bedingungen schon nach 5 Tagen gutes Wachstum in den Fibroblasten beobachtet. Die Bakterien wurden in der Kulturflüssigkeit sowie in und auf den Fibroblasten detektiert. Aus klinischen CSF (cerebrospinal fluid)-Proben von Patienten mit Neuroborreliose und Lyme arthritis wurde mittels der Kultivierung in Fibroblasten Borrelia nachgewiesen, obwohl die klinischen Proben PCR negativ waren (Tylewska-Wierzbanowska und Chimielewski).
Eine Detektion von Borrelia in Geweben, Zellkulturen erfolgt über Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie (Färbung), Fluoreszenz-markierte Antikörper oder durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH). Cy3 gelabelte Sonden, die gegen die 16S rRNA von Borrelia burgdorferi sensu lato hybridisieren, wurden mittels FISH in Zeckengewebe und Hautbiopsien von Rennmäusen eingesetzt (Hammer et al., 2001).

Borrelia burgdorferi interagiert mit Fibroblasten und Fibrozyten (Bindegewebszellen, die sich aus Fibroblasten entwickeln; können auch Antigen an die CD4+T-Zellen präsentieren). Die Bindung an die Fibrozyten ist unabhängig von den Oberflächenlipoproteinen ospA und ospC. Bei der Interaktion mit den Fibrozyten werden die Spirochäten im Gegensatz zu den Leucozyten nicht phagozytiert; sind jedoch vor der Immunantwort geschützt. B. burgdorferi besitzt Kollagenase- und Proteoglycanase-Aktivität. Eine hämolytische-Aktivität wird postuliert (Grab et al., 1999).

Menschliche dendritische Zellen (von der Haut; nicht von der Epidermis) phagozytieren Borrelia burgdorferi, wobei die Spirochäten im Cytosol und im Inneren von Phagolysosomen nachgewiesen wurden. Borrelia burgdorferi induziert eine IL-12-Produktion der dendritische Zellen vom Blut und aktiviert T-Zellen. IL-12-Protein wurde über ELISA und IL-12-mRNA über PCR nachgewiesen (Filgueira et al., 1996).

ospA
Das Operflächenlipoprotein ospA hat ein Molekulargewicht von 31-34 kDA. Basierend auf ospA-spezifische monoklonale Antikörper wurden acht verschiedene ospA-Serotypen definiert. OspA-Serotyp 1 korrespondiert zu B. burgdorferi sensu stricto, OspA-Serotyp 2 zu B. afzelii und OspA-Serotypen 3-8 zu B. garnii (J1-J9, B. burgdorferi sensu stricto, japanische Isolate) (Wang et al., 1999). Die Variabilität von B. garnii-Stämmen bezüglich der verschiedenen ospA-Serotypen spieglt sich in den PFGE-Mustern (DNA verdaut mit MluI und SmaI) wieder (Escudero et al., 2000).
B. burgdorferi aktiviert Monozyten mit einer resultierenden Induktion von Cytokinen IL-1b und TNFa als Mediatoren der Entzündung. Der Lipidanteil des ospA aktiviert die Monozyten über einen CD14-abhängigen Weg (Wooten et al., 1998).
Ein human leukocyte function-associated antigen (hLFA-1) einer T-Helferzelle ist eines der notwendigen Zelloberflächenmoleküle, welches den TCR (T cell receptor) bei der Erkennung des MHC (major histocompatibility complex) Class II unterstützt. Das Peptid hLFA-1 ist zu einem Epitop des ospA homolog. Diese Kreuzreaktion ist Auslöser bei Lyme-Arthritis von Autoimmunkrankheit (Gross et al., 1998).

C3b Inaktivierung
Der zentrale Schritt in der Komplement-Aktivierung ist die Bildung von C3b. Die meisten Bakterien aktivieren das Komplementsystem, welches zur Phagocytose und Formierung des Membrane Attack Complex (MAC) führt. MAC kann gewöhnlich nur auf der Oberfläche von Gram-negativen Bakterien, die eine äussere Zellmembran aufweisen, aufgebaut werden. Borrelia burgdorferi ist in der Lage, dem Komplementsystem zu entgehen. Ein Inhibitor des Komplementsystems ist der Faktor H aus Serum, welcher ein Cofaktor der Serin-Protease- Faktor I ist und die Bildung der C3bBb-Konvertase hemmt. B. afzellii und B. burgdorferi sensu stricto sind resistent gegenüber einer Komplement-Attacke; hingegen wird B. garinii durch das Komplementsystem inaktiviert. Die Resistenz von B. afzellii und B. burgdorferi sensu stricto basiert auf der Bindung des Faktors H sowie Faktor H-like Protein (FHL-1) an ein Oberflächenprotein der Grösse von 33 kDa sowie an das ospE (Alitalo et al., 2001).

Genexpression
ospA dient den Spirochaeten bei der Anlagerung im Darmgewebe der Zecke. Die Expression verschiedener Gene in B. burgdorferi wurde in der Zecke Ixodes scapularis zu verschiedenen Stadien des Lebenszyklus untersucht. OspA konnte in der Larve, im Nymphenstadium und in der ausgewachsenen Zecke nachgewiesen werden. Die Expression anderer Oberflächenproteine (ospC, mlp) variiert innerhalb der einzelnen Stadien. Die Expression von bba65 (p35) konnte in keinem Stadium festgestellt werden (Gilmore et al., 2001).
Die Genkassette vls besteht aus dem vlsE-Gen, kodierend für ein 34 kDa-Lipoprotein und einer upstream gelegenen "silent cassette" bestehend aus 15 Kassetten (keine Promotoren, RBS; jedoch ORFs). Die kodierende vlsE-Sequenz besteht aus einer Lipoprotein-Signalsequenz (19 AS), einer 5' unique sequence (invariant segment), 17 bp direct repeat, variablen Zentralkassette (vls1), 17 bp direct repeat und 3' unique sequence (invariant segment). Variable Regionen in der vls1-Zentralkassette unterliegen Rekombinationen mit Sequenzbereichen aus der "silent cassette" (Zhang et al., 1997).

PCR
PCR-Nachweissysteme für B. burgdorferi sensu lato basierend auf der Ziel-DNA kodierend für Flagellin-Gen (chromosomal kodiert), 16S rRNA-, 23S rRNA-Gen, p66-Gen (chromosomal kodiert und mit der Fähigkeit an das Zelladhäsionsmolekül Integrin zu binden), recA-Gen und ospA-Gen (Plasmid-kodiert) sind in der Literatur beschrieben worden. Nested PCR-Systeme unter Angabe der verwendeten Primer sind von Priem et al. 1997 beschrieben worden. Die Autoren erreichten eine Nachweisgrenze von 3 Borrelia/Probe. Mehr positive Ergebnisse wurden mit dem
p66-Primern als mit de
ospA-Primern erzielt. Valsangiacomo et al., 1996 detektierten Stämme von B. burgdorferi sensu lato mittels nested PCR bis zu einer Konzentration von 3 fg genomischer DNA. Das Zielgen in den Untersuchungen war das hbb-Gen, kodierend für ein Histon-ähnliches Protein HBb. In neueren Publikationen wurden real time PCR-Systeme zum Nachweis von B. burgdorferi sensu lato beschrieben. Mommert et al., 2001 verwendeten eine nested Light Cycler PCR-Methode über Bestimmung des Tm-Wertes des Amplikons. Die beschriebenen Tm-Werte der drei Genospecies liegen jedoch sehr eng zusammen. Bei Gewebeuntersuchungen waren 6 von 8 Patienten PCR positiv, detektiert wurde das p66-Gen (mit recA-Gen als Ziel-DNA für den Nachweis wurde eine geringere Spezifität erreicht). In einer Anleitung für den LightCycler zum Nachweis von Borrelia-Arten wurde das recA-Gen detektiert. Die Amplifikation erfolgte mittels zweier spezifischer Primer unter Einbau von SYBR-Green über Bestimmung der Tm-Werte bis zu einer DNA-Konzentration (Sensitivität) von 8fg (Mäkinen et al.). Rauter et al. beschrieben 2002 eine Methode zur Detektion von Borrelia genospecies über eine Sonde, die gegen das ospA-Gen gerichtet ist. 1000 Genomäquivalente von Borrelia ergaben Ct-Werte von 30; ein Genomäquivalent ergab Ct-Werte von 40.
Der Nachweis von Borrelia burgdorferi sensu lato aus klinischen Isolaten über real time PCR basierend auf TaqMan wurde über das Flagellin als Zielgen beschrieben (Schwaiger et al., 2001). Von 28 SF- (Synovialflüssigkeit)-Proben aus 27 Patienten wurden 5 Proben (17.9%) als positiv getestet (detektiert wurden 20 bis 41'000 Genomäquivalente). Von 56 CSF-Proben von 54 Patienten mit neurologischen Symptomen wurden nur eine Probe (18%) als positiv getestet (Grund: geringer Borreliosetiter, geringes CSF-Probevolumen für die Untersuchung). Getestet wurden zusätzlich potentielle Inhibitoren in klinischen Isolaten mit "spiking" Experimenten (kloniertes Flagellin-Gen).
Die PCR hat für die Detektion ihre höchste Sensitivität in Haut-Biopsien (68%) und Synovialis-Biopsien sowie Gelenk-Punktat (73%), deutlich weniger im Liqour (18%). Im Blut ist die PCR höchstens in den ersten Wochen nach Infektion positiv (IKMI-Flyer, 2002). Eine Sensitivität der PCR von 27% wurde in Urinproben beschrieben (Schnarr et al., 1998).
Patienten mit Arthritis können bis zu 10'000 Spirochäten pro ml in SF (synovial fluid) enthalten; Patienten mit EM bis zu 4'000 Spirochäten/ml. Generell ist in menschlichen Körperflüssigkeiten bei Patienten mit einer Anzahl von Borrelia von < 50 Organismen/ml zu rechnen, besonders in späten, chronischen Krankheiten.
Der cut off level (Detektionslimit) liegt bei ca. 10 Spirochäten. Für die Bestimmung der Sensitivität wird ein sogenannter "Goldstandard" benötigt, welcher für die meisten pathogenen Mikroorganismen von der Kultur ausgeht (Schmidt, 1997). Kulturbedingungen können das Wachstum von nur einer Art fördern. Die simultane Infektion von zwei pathogenen Borrelia sp. in Säugetieren konnte mittes PCR (Amplifikation ribosomaler RNA-Sequenzen und Flagellin-Gen) bestätigt werden (Zore, et al. 1999).
Inhibitoren der PCR sind in klinischen Proben von Relevanz. Die DNA-Extraktionsmethode hat einen Einfluss auf das Vorhandensein von Inhibitoren. Die PCR-Nachweismethode sollte eine Kontrollprobe mit Primern spezifisch für menschliche housekeeping genes z.B. Glycerinaldehyd-3-P-Dehydrogenase-Gen bzw. beta-globulin-Gen oder competetive DNA-Fragmente enthalten.
In Patienten im frühen Krankheitsstadium wurde eine inverse Korrelation zwischen serologischen Tests und PCR-Ergebnissen beobachtet: 90% unbehandelter Personen mit Erythema migrans sind positiv mittels PCR, im Gegensatz zu 14% IgG positiven und 37% IgM positiven. Eine erhöhte Sensitivität der PCR in Körperflüssigkeiten kurz nach der Behandlung der Patienten mit Antibiotika kann durch eine erhöhte Anzahl von toten Bakterien erklärt werden. B. burgdorferi sensu stricto konnte aus Proben von infizierten C3H/HeJ-Mäusen mit Arthritis während einer Behandlung mit Penicillin G mittels real time PCR (TaqMan, Flagellingen) nachgewiesen werden. Nach der Behandlung mit Antibiotika 8-21 Tage nach Infektion der Mäuse konnten noch Borrelia burgdorferi nachgewiesen werden (Pahl et al., 1999). Bei einem Vergleich der PCR-Resulate mit Kultivierungsdaten, ist bislang die Sensitivität des Nachweises von Borrelia sp. über klassische Kulturen (Nachweis lebender Spirochäten) tiefer als die über PCR (Schmidt, 1997).
In SF (Synovialflüssigkeit) von Patienten mit unbehandelter LA (Lyme-Arthritis) ist Plasmid-DNA von Borrelia nachgewiesen worden, genomische DNA wurde selten nachgewiesen.
Positive PCR steht im Einklang mit einer aktiven Krankheit; nach einer erfogreichen Behandlung ist die PCR negativ. Anmerkung: Nach einer Behandlung mit Antibiotika ist die PCR als Nachweismethode negativ in Urin-, SF- und CSF-Proben. Es konnte gezeigt werden, dass in Patienten mit Behandlungsresistenter Lyme-Arthritis Borrelia burgdorferi in SM-Proben (Synovialmembran) nachgewiesen wurden, wobei SF-Proben negativ waren (Priem et al., 1999).

HLA-Allele
HLA-Allele in der Regulation von Antikörper-Produktion in Lyme-Borreliose

Ein kleiner Kreis von Patienten, welcher an Lyme-Borreliose erkrankt ist, produziert keine spezifischen Antikörper gegen Borrelia burgdorferi. Das menschliche Leukozyt-Antigen (HLA) der Klasse II, ein heterodimeres Glykoprotein, spielt eine wesentliche Rolle in der Regulation der Antikörperproduktion. Wang und Hilton (2001) untersuchten die Unterschiede der HLA-Gene bei seropositiven und seronegativen Patienten mit Lyme-Borreliose. Die Autoren postulieren, dass das HLA-Allel HLA-DR7 sowie HLA-DR6 mit einer Antikörperbildung assoziiert ist; im Gegensatz zu HLA-DR1. Die HLA-Typisierung mittels PCR wurde mit Dynal Reli SSO Testkit (Oslo, Norwegen) durchgeführt.

Literatur
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